Mutacje JAK2 Exon 12 w przypadku czerwienicy purpurowej i idiopatycznej erytrocytozy ad

Thomas Hospital w Londynie i Belfast City Hospital w Belfaście (wszystkie w Zjednoczonym Królestwie) oraz od osób zapisanych w badaniu Mieloproliferative Disorders na Uniwersytecie Harvarda w Bostonie.5 Diagnozy przypisane przez miejscowych lekarzy zostały poddane przeglądowi centralnemu i zmienione zgodnie z ustalonymi kryteriami dla czerwienica prawdziwa, 24 nadpłytkowość samoistna, 25 i idiopatyczna mielofibrosa.26 Komisja ds. Etyki Badań Zaufania National Health Service w Addenbrooke zatwierdziła to badanie. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od każdego pacjenta. Mutation Screening
Izolację granulocytów i limfocytów T oraz testy kolonii hematopoetycznych przeprowadzono w sposób opisany wcześniej4. Poszczególne jednostki tworzące pęknięcia i kolonie erytroidalne niezależne od erytropoetyny zebrano do wody i gotowano. Startery kodujących egzonów JAK1, JAK2, JAK3, genu 2 kinazy tyrozynowej (TYK2) oraz dwóch przetworników sygnałowych i aktywatorów genów transkrypcyjnych (STAT5A i STAT5B) są wymienione na stronie www.sanger.ac.uk/genetics/CGP. ; wszystkie dodatkowe użyte startery są wymienione w Tabeli w Dodatku Uzupełniającym (dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Przeprowadziliśmy PCR specyficzny dla allelu, stosując DNA z granulocytów lub z całkowitej krwi obwodowej, temperaturę hybrydyzacji 62 ° C, startery kontrolne eksonów JAK2 i startery swoiste dla alleli zawierających mutację K539L (prowadząc do zastąpienia lizyny w pozycji 539 z leucyną), mutacją N542-E543del (powodującą delecję asparaginy w pozycji 542 i kwasem glutaminowym w pozycji 543), mutacją F537-K539delinsL (prowadzącą do zastąpienia fenyloalaniny w pozycji 537 przez lizynę w pozycji 539 pojedynczą leucyna) lub mutacja H538QK539L (powodująca substytucję glutaminy dla histydyny w pozycji 538 i leucynę dla lizyny w pozycji 539). Namnożyliśmy DNA z kolonii in vitro przy użyciu starterów egzonowych 12 i zsekwencjonowaliśmy lub genotypowaliśmy produkty PCR, stosując trawienie za pomocą AseI.
Biopsja szpiku kostnego
Próbki biopsji szpiku z grzebienia biodrowego utrwalono w obojętnej buforowanej formalinie. Niektóre zostały przetworzone w parafinie, a inne w metakrylanach metylu po odwapnieniu w 5,5% EDTA. Skrawki (o grubości do 3 .m) cięto i wizualizowano stosując hematoksylinę i eozynę lub barwnik Wrighta-Giemsy. Wszystkie zabarwione skrawki oglądano pod mikroskopem optycznym (Olympus-BX51) wyposażonym w soczewkę okularową 10 x -H26,5. Zdjęcia o niskiej mocy (20 ×) i dużej mocy (40 ×) uzyskano za pomocą aparatu cyfrowego (Pixera Pro150ES) i oprogramowania Studio 3.0.1 (Adobe Systems).
Mutageneza kierowana lokalnie i produkcja retrowirusa
Wprowadziliśmy mutacje V617F, H538QK539L, K539L, N542-E543del i F537-K539deliny L do mysiego komplementarnego DNA Jak2 w bicistronowym wektorze retrowirusowym kodującym zielone białko fluorescencyjne (MSCViresGFP), 8 z zastosowaniem mutagenezy ukierunkowanej przez QuikChange (Stratagene). Pełna sekwencja nukleotydowa każdego wektora retrowirusowego została potwierdzona przed użyciem. W celu wytworzenia każdego retrowirusa połączono równe ilości wektora retrowirusowego Jak2 i plazmidów opakowaniowych (Ecopak), inkubowano z FuGene (Roche) przez 15 minut, a następnie dodano do ludzkiej zarodkowej linii komórek nerkowych, 293T
[hasła pokrewne: amoksycylina dla gołębi, usg kolana kraków, pierścień landolta ]
[podobne: terapia kranio sakralna, weekend nad morzem dla dwojga, olx mosina ]