Mutacje JAK2 Exon 12 w przypadku czerwienicy purpurowej i idiopatycznej erytrocytozy cd

Supernatanty zebrano 48 godzin później i zastosowano do transdukcji komórek BaF3 eksprymujących mysi receptor erytropoetynowy (komórki BaF3 / EpoR) 27 lub mysich komórek szpiku kostnego. Proliferacja komórek BaF3 i Western Blotting
Komórki BaF3 / EpoR utrzymywano w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% surowicy płodowo-cielęcej i 10% pożywki kondycjonowanej komórkami WEHI-3B, jako źródło interleukiny-3, i infekowano retrowirusami retrowirusowymi zawierającymi wektory MSCViresGFP kodujące mutanty lub dzikie białka. wpisz Jak2. Zieloną fluorescencyjną białkową populację dodatnią z każdej transdukcji oczyszczono przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej 2 dni później, a następnie ekspandowano w pożywce RPMI-1640 z 10% płodową surowicą cielęcą i 10% pożywki uwarunkowanej WEHI-3B przez 3 do 8 dni. . W celu oznaczenia nadwrażliwości na czynnik wzrostu transdukowane komórki BaF3 / EpoR hodowano w nieobecności interleukiny-3, a liczbę żywych komórek mierzono w dniach 2 i 4 z zastosowaniem wykluczenia błękitem trypanu. Dane z czterech niezależnych eksperymentów połączono w analizach.
Do immunoprecypitacji i badań metodą Western blot komórki BaF3 / EpoR eksprymujące dzikiego typu lub zmutowane Jak2 głodzono przez 4 do 5 godzin w pożywce RPMI-1640 zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej, a następnie granulowano i zamrażano do późniejszej analizy. Komórki stymulowane 10 U na mililitr erytropoetyny przez 10 minut służyły jako kontrola pozytywna. Do analizy Jak2 i Stat5 komórki 3 x 107 poddano lizie w 10 mM TRIS kwasie solnym (pH 7,4) z 150 mM chlorkiem sodu i 0,5% buforem NP-40 zawierającym inhibitory fosfatazy i proteazy. Supernatant białka strącono przeciwciałem anty-Jak2 (Upstate Cell Signaling Solutions) lub przeciwciałem anty-Stat5 (Santa Cruz Biotechnology). Precypitaty osuszono za pomocą przeciwciał przeciwko fosforylowanej Stat5 (fosfotyrozyna w pozycji 694) (Cell Signaling Technology), fosfotyrozyna (4G10) (Upstate Cell Signaling Solutions), Jak2 lub Stat5 (Santa Cruz Biotechnology). Alternatywnie, całkowite lizaty komórkowe ponownie zawieszono w buforze do próbek dodecylosiarczanu litu (Invitrogen), a następnie osuszono z przeciwciałami przeciwko fosforylowanej pozakomórkowej regulowanej kinazy i 2 (Erk1 i Erk2) (fosfotreonina w pozycji 202 i fosfotyrozyna w pozycji 204 w Erk) lub w stosunku do całości Erk (Cell Signaling Technology).
Test przeszczepu szpiku kostnego u myszy
Przeszczepianie szpiku kostnego przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio28. W skrócie, supernatanty retrowirusowe miareczkowano przez oznaczenie procentu komórek BaF3, które były pozytywne dla białka o zielonej fluorescencji 48 godzin po wprowadzeniu wektora retrowirusowego. Do transfekcji komórek szpiku kostnego stosowano supernatanty zawierające równe poziomy dzikiego typu Jak2 lub V617F lub K539L Jak2. Myszy dawcy BALB / c traktowano 150 mg 5-fluorouracylu na kilogram masy ciała, a komórki zebrane z kości udowej i piszczeli 7 dni później hodowano przez 24 godziny w pożywce do transplantacji (pożywka RPMI-1640, 10% surowica płodowa cielęca 6 ng mysiej interleukiny-3 na mililitr, 10 ng ludzkiej interleukiny-6 na mililitr i 10 ng mysiego czynnika komórek macierzystych na mililitr). Komórki szpiku kostnego odwirowano przy 2500 obrotach na minutę przez 90 minut w obecności ml supernatantu retrowirusowego i 10 .g polibrenu na 4 x 106 komórek.
[podobne: przychodnia kietrz lekarze, przeglądarka na leczenie uzdrowiskowe, apteka dyżurna mrągowo ]
[przypisy: szynowanie zębów włóknem szklanym, dermatolog na nfz kraków, terapia poznawczo behawioralna warszawa ]